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您是否曾问过自己，STED 是如何工作的？ STED、STORM 和 MINFLUX 之间有什么区别？什么是\"目标读出”和\"随机读出”？ RESOLFT到底是如何运作的？请仔细阅读，找出答案。

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阿贝衍射屏障挑战

如果单个标记分子（下面的黑点）比衍射屏障更近，它们就不能单独成像 - 它们各自的模糊图像重叠，您看到的只是不清晰、模糊的汤，在 200 nm 下没有任何细节。

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由于衍射时，聚焦激发激光（绿色，如下）照射的区域始终大于所用光波长的一半。位于该区域内的每个分子都会发光，如果有多个分子，则无法区分它们。< /p>解决方案

所有与亚衍射大小区域相邻的荧光团都暂时保持黑暗，以便它们可以单独注册。这样，它们的模糊图像就不会重叠，可以按顺序记录。Thebasic超分辨率的接收确实非常简单——引入一个可控的开/关染料标记的转变。

因此，染料是纳米级分辨率的关键。abberior 专门设计具有可通过第二光源控制的开/关转换的染料。

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STED 受激发射耗尽原理

STED 显微镜使用第二个红色- 移动光束。所有用这种 STED 光照射的分子都被限制在基态（关闭模式）。关键是修改 STED 光束，使其在中心有一个小孔，在该孔中强度为零，例如通过赋予其众所周知的 STED\"甜甜圈”形状。这样，除了甜甜圈中心的分子之外，所有分子都暂时保持黑暗。任何检测到的荧光都必须来自这个亚衍射大小的点——现在可以更精确地知道它们的位置。衍射屏障被打破。

下面是荧光分子 STED 过程的 Jablonski 图。从基态 S0 到第一激发态 S1 的光激发 (1) 后，有两种方式可以返回基态：如果分子位于具有 STED 光子的区域，则电子被激发进入基态，并且没有荧光发生 (2)。如果分子位于甜甜圈的中心，则在荧光发射下它会返回基态cence光子（3）。

设置

为了实施 STED 技术，显微镜设计除了激发光束之外还需要考虑第二个聚焦光束（STED 光）。受到高于饱和阈值的 STED 光照射的区域中的分子被迫进入关闭状态。相位板负责将普通 STED 光束转换为环形。

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完整的图像是通过扫描穿过样品的两束光束的重叠焦点来创建的。在每个位置，都会检测到来自焦点正中心的信号。

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结果

STED 显微镜是第一个放弃光学显微镜中衍射屏障的技术。STED 具有理论上无限的分辨率，可以用\"修改的”阿贝方程来表示：

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其中 Δx 表示空间中可分辨的最小特征，λ 表示激发波长，I 表示 STED 强度。NA 是物镜的数值孔径，I sat表示染料对 STED 光子的反应程度。

严格来说，探测器只需要看到一个光子即可识别具有纳米级分辨率的单个分子（或簇）。无需数学算法即可渲染下面的图像突破分辨率障碍，STED 是纯物理学！一旦分子分开，它们可以更好地本地化（如下）。

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RESOLFT 可逆饱和光学荧光跃迁原理

RESOLFT 代表一般切换原理：切换机制不再需要纯电子方式，而是可以包括开关机制，例如分子的构象变化。严格来说，STED 方法是 RESOLFT 概念的一种可能实现。

该方法与 STED 所示类似 - 光束扫描设置，激发光束和切换光束重叠。

根据开关的实现，典型的饱和强度和典型的开关时间是特征性的 - 例如构象变化具有低得多的开关inter密度，而切换时间比电子态（对于 STED）要长得多。

下面显示的是通过光诱导化学反应实现 RESOLFT 开关的示例，该反应从无色、非荧光前体。

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设置

其实现与 STED 所示类似 - 具有重叠激发光束和切换光束的光束扫描设置。在 STED 设置中，切换光束将表示为 STED 光束。相位板负责在焦平面上重新分配切换光，即创建甜甜圈。

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结果

RESOLFT 理论上具有无限的分辨率（参见 STED 部分的方程），因为只有焦点中心的分子处于开启状态。

探测器只需要看到至少一个光子即可探测个体纳米级分辨率上的分子（簇）。

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PALM 光激活定位显微镜STORM 随机光学重建显微镜原理

基本原理PALM和STORM规定所有分子都在关闭状态下制备，然后，一小部分单个分子随机切换到开启状态。通常，这两种状态都是通过分子状态之间的光致异构化（例如顺式/反式异构化）来实现的

精确读出每个分子的位置后，将它们切换回黑暗状态或用读出光漂白。随机切换的分子子集的顺序读出会产生标签距离的高分辨率图像贡献。

设置

PALM 和 STORM 实现分子位置的随机读出。因此，通过重叠所有识别的位置来迭代拍摄图像。

在实施方面，PALM 或 STORM 显微镜非常简单：带有单光子敏感区域探测器的宽视场设置。

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结果

PALM 和 STORM 方法理论上提供无限的本地化单个染料（簇）的定位准确性。定位精度取决于一种染料（团簇）发射的光子数量 (N)：

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其中Δx表示每个单独分子的定位精度，λ表示激发波长，NA是数值ape物镜的结构。

为了提供高分辨率图像，PALM 和 STORM 概念必须利用数值方法来计算和覆盖单个分子的已识别位置。